Os nevos melanocíticos congênitos (NMC), definidos por sua presença ao nascimento ou nas primeiras semanas de vida, são originários de proliferações de células melanocíticas benignas derivadas da crista neural. As características clínicas do NMC são diversas, como localização no corpo, espectro mais diversificado de cores e alterações topográficas da superfície. As complicações potenciais dos NMC incluem desenvolvimento de melanoma e envolvimento do sistema nervoso central denominado melanose neurocutânea (MNC).

A classificação dos NMC tem sido historicamente definida apenas pelo tamanho. Recomendações recentes foram publicadas com base no consenso de especialistas, utilizando categorias de tamanho adulto previsto (PAS; do inglês, predicted adult size), número de NMC acompanhantes, localização anatômica e vários descritores topográficos. Um NMC pequeno é definido como tendo menos de 1,5cm de PAS, e o médio até 20cm de PAS (M1: 1,5‐10cm, M2:> 10‐20cm). NMC grandes e gigantes são classificados quando o PAS está entre 20 e 40cm (L1:> 20‐30cm, L2:> 30‐40cm) e maiores que 40cm (G1:> 40‐60cm, G2:> 60cm), respectivamente.1

NMC pequenos e médios são relatados em aproximadamente 1:100 nascimentos,2 enquanto NMC grandes e gigantes têm prevalência estimada de 1:20.000 a 1:50.000 nascimentos e 1:200.000 a 1:500.000 nascimentos, respectivamente.3–5

NMC abrigam predominantemente mutação somática NRAS ou BRAF pós‐zigótica. No entanto, diferentes mutações geralmente dependem do tamanho do nevo. Na grande maioria dos casos, NMC pequenos e médios são observados com mais frequência como tendo mutação V600E no gene BRAF, enquanto nevos grandes/gigantes abrigam mutações NRAS (Q61) com mais frequência.6–8 NMC geralmente são neoplasias melanocíticas benignas, mas às vezes é difícil diferenciar o NMC do melanoma, especialmente no estágio inicial do melanoma. Portanto, biópsias ou cirurgia são necessárias para realizar exame histopatológico suplementar. A mutação V600E no gene BRAF é o driver genético mais comum no melanoma e codifica uma serina/treonina quinase na via RAS/mitogen‐activated protein kinase (MAPK).9–12

Notavelmente, mais de 80% dos nevos melanocíticos abrigam mutações no gene BRAF,10,13 incluindo os nevos melanocíticos que são precursores do melanoma.14

No melanoma, a presença da mutação V600E no gene BRAF está correlacionada com certas características histopatológicas, incluindo dispersão ascendente intraepidérmica de melanócitos, formação de ninhos de melanócitos intraepidérmicos, espessamento da epiderme e células tumorais maiores.15 Da mesma maneira, os nevos melanocíticos com mutação V600E no gene BRAF estão associados a padrão dermatoscópico globular e padrão de crescimento histológico predominantemente dérmico.13,16 Esses resultados sugerem que a mutação V600E no gene BRAF pode afetar as características e o comportamento dos nevos.

Mutações no gene BRAF (homólogo B do oncogene viral do sarcoma murino v‐raf) foram detectadas com alta frequência em NMC, especialmente em NMC pequenos e médios.17 Entretanto, que seja do conhecimento dos autores, não há relatos relevantes sobre o efeito da mutação V600E no gene BRAF na atividade proliferativa e na histopatologia dos NMC. Como tal, o estudo da biologia do NMC pode aprofundar a compreensão das vias que levam ao melanoma.

Neste estudo, o objetivo primário foi determinar a atividade proliferativa (pelo Ki67) e o padrão histopatológico em NMC com mutação V600E no gene BRAF.

Este estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional do Capital Institute of Pediatrics (SHERLL2020054) e foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinque.

Microscopia de fluorescência confocal a laser (MFCL)

Se houvesse muitas partículas de melanina na amostra, que afetasse a avaliação dos resultados, a microscopia de fluorescência confocal a laser (MFCL) era utilizada para esclarecer o diagnóstico. Os cortes histológicos foram desparafinizados em xileno e reidratados com etanol 100%, 95%, 85% e 75% por 5 minutos, respectivamente, e enxaguadas com solução salina tamponada com fosfato por 5 minutos por três vezes. Após a recuperação do epítopo induzida por calor no microondas por 15 minutos e bloqueio com soro normal de cabra a 5% por 1 hora em temperatura ambiente, os cortes histológicos foram incubados com anticorpo monoclonal anti‐humano de camundongo para melanina A e anticorpo monoclonal de coelho Ki‐67 anti‐humano (Abcam, Cambridge, MA, EUA) em albumina de soro bovino a 5%/solução salina tamponada com Tris. Para a detecção, anticorpos anticamundongo marcados com Alexa Fluor 488 e anticorpos anticoelho de cabra marcados com Alexa Fluor 595 (Abcam, Cambridge, MA, EUA) e 4’,6‐diamino‐2‐fenilindol (DAPI) foram utilizados. Para análise de colocalização, as células foram simultaneamente marcadas com anticorpos de camundongo antimelanina A e anticorpos de coelho anti‐Ki‐67 e detectadas com anticorpos anticamundongo de cabra marcados com Alexa Fluor 594 ou anticorpos anticoelho de cabra marcados com Alexa Fluor 488. O procedimento foi realizado manualmente. Controles positivos e negativos foram incluídos em cada processamento de amostras. A porcentagem de células imunomarcadas foi contada sob grande aumento (fig. 1).

Figura 1.

Características histomorfológicas do nevo melanocítico congênito. Padrão de crescimento congênito com as células névicas circundando estruturas anexiais e envolvimento de células do nevo em torno de vasos e disseminação de melanócitos entre os feixes de colágeno. Os nevos com a mutação V600E no gene BRAF (A) se estendem mais profundamente na derme do que os nevos do tipo selvagem (B). (A‐B, coloração pela Hematoxilina & eosina, 40×).

(1.1MB).

Os dados dos 12 pares combinados incluindo pacientes (n=24) e nevos (n=24) são apresentados na tabela 1. Em relação às características dos NMC nos grupos de mutação e controle, os grupos eram muito parecidos em relação a idade, sexo e localização. Não houve diferenças estatisticamente significantes em termos de idade, sexo, história de melanoma e história de câncer de pele não melanoma entre os grupos com mutação e o grupo controle.

Havia 21 nevos compostos no presente estudo (21 de 24; 87,5%). No entanto, havia apenas um nevo intradérmico no grupo mutação (8,3%), enquanto havia dois no grupo controle (16,6%).

A imunorreatividade com Ki67 foi restrita ao núcleo de células positivas em um padrão granular distinto de coloração e muitas vezes não era homogênea. Ocasionalmente, a região nucleolar foi marcada de maneira proeminente. Não foi observada coloração citoplasmática. Imunorreatividade mais frequente foi observada na junção dermoepidérmica (figs. 2 e 3).

Figura 2.

Imuno‐histoquímica com Ki67 em nevo melanocítico congênito. A imunorreatividade com Ki67 foi restrita ao núcleo das células em padrão granular distinto e mais frequentemente foi observada em células localizadas na junção dermoepidérmica (A‐B, 100×).

(0.76MB).

Figura 3.

Os núcleos corados em marrom indicam expressão positiva de Ki67 (A, 400×). A microscopia confocal de fluorescência a laser pode facilmente eliminar a interferência dos grânulos de melanina. Células com fluorescência vermelha no centro e fluorescência amarela ao redor são células imunorreativas com Ki67 (B, 600×).

(0.68MB).

A tabela 2 mostra a proporção de células imunorreativas com Ki67 em cada par de nevos. Diferenças estatisticamente significantes foram detectadas entre o grupo com mutação e o grupo controle (p=0,041).

As diferenças na extensão das células névicas em profundidade e no número de ninhos de células névicas entre o grupo com mutação e o grupo controle foram estatisticamente significantes, com valores de p=0,002 e 0,007, respectivamente, enquanto a diferença no tamanho dos ninhos de células névicas entre os dois grupos não foi estatisticamente significante (tabela 2).

Entre os casos, a correlação entre o número de ninhos de células névicas e a taxa de positividade para Ki67 é mostrada na figura 4. O número de ninhos de células névicas (análise de regressão linear, coeficientes de correlação de Spearman: coeficiente=0,603; p=0,001; fig. 1) foram fortemente correlacionados com a proporção de células imunorreativas com Ki‐67. No entanto, a imunorreativa com Ki‐67 não apresentou correlação significante com a extensão das células névicas em profundidade, tamanho dos ninhos de células névicas e tamanho do nevo, e os coeficientes de correlação foram 0,11, 0,15 e 0,01, respectivamente.

Figura 4.

Correlação entre Ki‐67 e números de ninhos.

(0.08MB).

A avaliação IHQ do gene BRAF foi realizada em 10 casos de maneira cega (sem conhecimento dos resultados do sequenciamento do gene antes da análise dos dados da avaliação). Todos os sete nevos sem imunorreatividade para a mutação V600E no gene BRAF eram negativos para a mutação BRAF, e todos os três nevos com imunorreatividade para a mutação V600E no gene BRAF tinham a mutação V600E no gene BRAF. Nenhuma outra mutação somática recorrente foi identificada.

No momento, há poucos relatos na literatura sobre a associação de mutação genética com a histopatologia e atividade proliferativa de NMC.13,19,20 Esses relatos foram estudos holísticos e não diferenciaram entre nevos congênitos e adquiridos. Que seja de conhecimento dos autores, este é o primeiro estudo a demonstrar a relação entre a mutação no gene BRAF e a atividade proliferativa e aspectos histopatológicos de NMC.

De acordo com as características histopatológicas, os NMC podem ser juncionais, compostos ou exclusivamente intradérmicos. As características histopatológicas estão relacionadas principalmente com o tamanho do nevo.21 Quase todos os nevos incluídos neste estudo eram compostos (21 de 24; 87,5%) e as características histopatológicas foram consistentes com o padrão congênito, como simetria, boa circunscrição, ninhos uniformes na epiderme equidistantes uns dos outros, ninhos de melanócitos e melanócitos individuais na derme que diminuem de tamanho a medida que se aprofundam na derme, células névicas dispostas ao redor dos vasos e estruturas anexiais e dispersas entre os feixes de colágeno.22 É digno de nota que a diferença na profundidade do nevo foi significante entre os dois grupos pareados. As células névicas no grupo de mutação no gene BRAF se estendem mais profundamente do que no grupo sem mutação. Esse fenômeno pode ser causado pelo aumento da atividade proliferativa das células névicas após a mutação no gene BRAF. A profundidade da infiltração do nevo também foi positivamente correlacionada com o tamanho do nevo.21 Em razão do exposto, pode‐se chegar a uma conclusão preliminar de que a profundidade da infiltração do nevo não está relacionada apenas com o tamanho do mesmo, mas também com a mutação V600E no gene BRAF no NMC. Além disso, os achados deste estudo ampliam o conhecimento da correlação genótipo‐fenótipo em NMC.

O anticorpo monoclonal Ki‐67 tem sido amplamente utilizado em histopatologia e mostrou ser de grande valor para a classificação de tumores e na correlação com a sobrevida de pacientes em muitas neoplasias malignas humanas.23 Porém, os dados sobre a expressão do marcador de atividade proliferativa Ki67 em NMC são limitados. Soyer incluiu nevos melanocíticos benignos em seu estudo e encontrou diferenças significantes na expressão do antígeno Ki‐67 entre nevos, melanoma primário e metastático.24

A mutação V600E no gene BRAF é observada em nevos com alta frequência10 e é uma mutação condutora na patogênese do melanoma.25 A mutação V600E no gene BRAF ativa temporariamente a proliferação de melanócitos névicos e induz a expressão de p16 que, em resposta, interrompe a proliferação de melanócitos.26 Mas a parada é reversível, pois alguns nevos acabam se transformando em melanomas cutâneos.27 Há um equilíbrio dinâmico entre a hiperplasia e a inibição dos nevos e, se esse equilíbrio for rompido, é provável que evolua para melanoma.

No presente estudo, houve diferença estatisticamente significante na atividade de proliferação entre os nevos com mutação V600E no gene BRAF e o grupo controle. Assim, com a mutação V600E no gene BRAF, o NMC pode ter maior atividade proliferativa e talvez ser mais suscetível a outros fatores irritantes, como exposição solar e fricção, e eventualmente progredir para melanoma.

Que seja de conhecimento dos autores, foi demonstrado que a atividade proliferativa de NMC está positivamente correlacionada com o número de ninhos de células névicas, mas não com o tamanho dos ninhos. Portanto, o número de ninhos pode ser um índice de atividade proliferativa e pode ser usado em estudos futuros.

A pesquisa é preliminar, e os resultados terão que ser validados em escala maior em outras pesquisas. Estudos adicionais de nevos prometem aumentar a compreensão dos mecanismos da nevogênese e da transição de neoplasia benigna para maligna.

O presente estudo demonstra que a mutação V600E no gene BRAF pode aumentar a atividade proliferativa e afetar as características histopatológicas dos NMC em crianças. Por outro lado, as características histopatológicas de um NMC podem fornecer informações relevantes sobre seu background molecular, incluindo a presença da mutação V600E no gene BRAF, que é a causa mais comum de tumores melanocíticos e a alteração com alvo terapêutico mais comum no melanoma. Maior compreensão da correlação genótipo‐fenótipo em NMC pode facilitar um diagnóstico mais preciso e um manejo mais adequado desses tumores melanocíticos humanos extremamente comuns.

Este trabalho recebeu suporte financeiro da Research Foundation of the Capital Institute of Pediatrics (número do projeto: LCPY‐2021‐04).

Jianyou Chen: Aprovação da versão final do manuscrito; concepção e planejamento do estudo; elaboração e redação do manuscrito; obtenção, análise e interpretação dos dados; participação efetiva na orientação da pesquisa; revisão crítica da literatura; revisão crítica do manuscrito.

Gaolei Zhang: Aprovação da versão final do manuscrito; concepção e planejamento do estudo; elaboração e redação do manuscrito; revisão crítica da literatura.

Xiaoyan Liu: Aprovação da versão final do manuscrito; obtenção, análise e interpretação dos dados; participação efetiva na orientação da pesquisa.

Ping Tu: Análise estatística; aprovação da versão final do manuscrito; obtenção, análise e interpretação dos dados; participação efetiva na orientação da pesquisa; revisão crítica da literatura; revisão crítica do manuscrito.

Nenhum.