Para a coleta de amostras de CECC de pacientes foi obtida a aprovação do Comitê de Ética do First Hospital of Shanxi Medical University. O tecido de CECC foi coletado de dez pacientes após a cirurgia, e os detalhes cirúrgicos desses pacientes são mostrados na tabela 1. O patologista confirmou o diagnóstico na amostra.

Cortes histológicos de tecido tumoral emblocado em parafina foram secos a 90°C durante 4 horas, desparafinizados em xileno e depois reidratados em soluções graduadas de etanol. Os cortes histológicos resfriados foram imersos em solução de peróxido de hidrogênio a 0,3% durante 15 minutos para bloquear a atividade da peroxidase endógena, enxaguados com PBS durante 5 minutos e bloqueadas com solução de BSA a 3% à temperatura ambiente durante 30 minutos. Após lavagem com PBS, os cortes foram incubados com anticorpos (Abcam, Cambridge, MA, EUA) por 1 hora em tampão de bloqueio BSA a 1%, seguido de incubação por 1,5 hora com anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluro 549 (Thermal Fischer) e DAPI. A reação de imunofluorescência foi avaliada através de microscópio confocal Zeiss LSM510 equipado com objetiva de imersão de 63×.

Células A431 (células de CECC humano) e SCC7 (células de CECC de camundongo) foram obtidas do Cell Bank of Shanghai Institute of Cell Biology (Xangai, China). Essas células foram mantidas em meio de cultura DMEM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA), que é suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina‐estreptomicina. As células foram cultivadas em incubadora umidificada a 37°C com 5% de CO2 (Sanyo Osaka, Japão).

Células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de doadores de sangue foram isoladas utilizando o método de gradiente de Ficoll, e as células T CD8+ foram isoladas de 1,25×107 CMSP utilizando o kit Easy Sep Human CD8+ T Cell Isolation.

A extração do RNA total foi realizada utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e a transcrição reversa utilizando o kit cDNA Synthesis (Takara, Japão). A quantidade e a densidade do RNA foram verificadas por espectrofotômetro. O QRT‐PCR foi realizado utilizando o kit SYBR Green Master MIX (Takara, Japão), de acordo com as instruções do fabricante. Os ensaios foram realizados em triplicata e a expressão gênica relativa foi determinada pelo método 2−ΔΔCt.

METTL3 forward: 5’‐ CATCCGTCTTGCCATCTCTAC‐3’

METTL3 reverse: 5’‐ GACCTCGCTTTACCTCAATCA‐3’

METTL14 forward: 5’‐ GCATCACTGCGAATGAGAAATG‐3’

METTL14 reverse: 5’‐ CAGAACCGCACCAGAGAAATA‐3’

RMB15 forward: 5’‐ GCCCAACTCAAGATCACTCA‐3’

RBM15 reverse: 5’‐ AGCCAGGAGAATGGCATAAC‐3’

WTAP forward: 5’‐ AATGGTAGACCCAGCAATCAA‐3’

WTAP reverse: 5’‐ CGTAAACTTCCAGGCACTCA‐3’

VIRMA forward: 5’‐ GAGGCGGATCCTTTGAGTTT‐3’

VIRMA reverse: 5’‐ AACGACCTGAGAGAGGGATAG‐3’

FTO forward: 5’‐ AGAGCGGGAAGCTAAGAAAC‐3’

FTO reverse: 5’‐ GCCACTGCTGATAGAACTCAT‐3’

ALKBH5 forward: 5’‐ GTGGGTATGCTGCTGATGAA‐3’

ALKBH5 reverse: 5’‐ TCGCGGTGCATCTAATCTTG‐3’

Para extrair proteínas totais, os lisados celulares foram obtidos utilizando tampão RIPA (Beyotime, Xangai, China) suplementado com fosfatase e inibidores de protease (Yeasen, Xangai, China). Um total de 15μL de proteína foi injetado em um gel Bis‐Tris SDS/PAGE e transferido para membranas de PVDF. Após bloqueio com BSA a 5%, as membranas foram incubadas com anticorpo primário durante a noite a 4°C. As membranas foram então expostas ao anticorpo secundário durante 60 minutos. As tiras foram incubadas com kit ECL e analisadas por sistema de imagem. A análise densitométrica foi realizada com o software Adobe Photoshop CS6.

Células T CD8+ purificadas foram obtidas por seleção negativa. As células de CECC foram adicionadas a células T CD8+ purificadas na proporção de 1:10‐50 e cultivadas em placas de 48 poços (Costar 3548, Cambridge, MA) em meio RPMI 1640. IL‐2 (50 unidades/mL, Chiron, Emeryville, CA) foi adicionado a cada poço começando no 1° dia e a cada 2 a 3 dias depois disso. As células de CECC foram colhidas no dia 7 e analisadas em relação à atividade lítica em triplicata utilizando o ensaio CCK‐8.

O ensaio imunoenzimático (ELISA) para detecção de citocinas foi realizado com kits (Boster Bio, Wuhan, China).

Um total de 103 células foi inoculado em cada poço das placas de 96 poços. Em cada intervalo (24, 48, 72 e 96 horas), 10μL de solução CCK‐8 (Yeasen, Shanghai, China) foram adicionados aos poços em sextuplicata. Os poços foram incubados durante 3 horas, e a absorbância de cada poço foi determinada a 450nm.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do First Hospital, Shanxi Medical University. Camundongos C57BL/6 com 8 semanas de idade foram mantidos de acordo com as diretrizes dos 3Rs (reduzir, reutilizar e reciclar). Um total de 1×107 células SCC7 ressuspensas em 100μL de PBS foi inoculado por via subcutânea no flanco esquerdo dos camundongos. Quando o volume do tumor atingiu 50‐100 mm3, foi injetado anticorpo anti‐PD‐1 (200μg/camundongo) isolado ou combinado com vacina contra HPV (0,25μL/camundongo). Após a detecção do tumor, seu tamanho foi medido com paquímetro a cada cinco dias, e o volume do tumor foi calculado como volume (cm3)=C×L2×0,5, com C e L representando os diâmetros maior e menor, respectivamente.

O kit de ensaio de metilação de RNA m6A (Abcam, ab185912) foi utilizado para avaliar o conteúdo de m6A no RNA total.

Os poli (A) + RNAs (400 ng) foram diluídos duas vezes e colocados em membrana de náilon (GE Healthcare, EUA). Resumidamente, as membranas foram então submetidas a reação cruzada com UV, bloqueadas, incubadas com anticorpo m6A e conjugado anti‐IgG de coelho com peroxidase de rábano, e finalmente detectadas com um kit de substrato de 3,3’‐diaminobenzidina peroxidase. Os mesmos 400 ng de poli(A)+ RNAs foram colocados na membrana, corados com azul de metileno 0,02% em acetato de sódio 0,3M por 2 horas e lavados com água livre de ribonuclease por 5 horas.

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SPSS versão 19.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EUA) ou GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, EUA), como descrito anteriormente. Os valores são apresentados como média±desvio padrão (DP). Para comparações, foram realizados o teste t de Student e o teste ANOVA unidirecional pelo teste de diferença mínima significante, como apropriado. Valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significante.

Foram selecionados cinco amostras de tecido tumoral de pacientes com CECC vacinados contra HPV e outras cinco não vacinados contra HPV, a fim de determinar o efeito da vacina contra HPV nas células imunes em tecidos humanos de CECC, e foi analisada a infiltração de CD8, CD4, NK, DC e macrófagos em tumores de CECC por imunofluorescência. Houve diferença estatística significante entre os dois grupos nos cinco tipos de células imune. A expressão de CD8, CD4, CD69, CD11c e CD163 nos tumores humanos no grupo vacinado estava significantemente aumentada (fig. 1).

Figura 1.

Diferenças no microambiente imunológico em tecidos de CECC de pacientes vacinados e não vacinados contra HPV. (A) Diferenças no microambiente imunológico (CD8, CD4, NK, DC, macrófago) em tecidos de CECC. (B) Análise estatística com uso do software Image J da porcentagem de células imunológicas positivas. **p<0,01, ***p<0,001.

(1.1MB).

Para investigar o efeito da vacina contra o HPV na atividade das células T CD8+, foi realizada cocultura de células T CD8+ com células A431 nas proporções 10:1, 25:1 e 50:1 e adicionados 2μg ou 10μg da vacina bivalente contra o HPV Cervarix (GSK, 0,5μg/mL). As células T CD8+ mostraram maior atividade citotóxica após a adição da vacina contra o HPV; entretanto, as diferenças na atividade indutora de morte celular da vacina contra o HPV em diferentes concentrações nas células A431 não foram estatisticamente significantes em determinada razão potência‐alvo (fig. 2A). Para explorar o efeito da vacina contra HPV na produção de citocinas no sistema de cocultura, foram examinados IFN‐γ, TNF‐α, TGF‐β, IL‐17, IL‐12 e IL‐33 no sobrenadante. A secreção de IFN‐γ, TNF‐α, TGF‐β e IL‐17 aumentou significantemente após a adição de 2μg de vacina contra o HPV, enquanto a produção de IFN‐γ, TNF‐α, TGF‐β e IL‐33 aumentou após a adição de 10μg de vacina contra HPV (fig. 2B).

Figura 2.

Efeito da vacina contra HPV na atividade das células T CD8+ no CECC. (A) Ensaio de morte de células T CD8+ em células A431. (B) Produção de fatores inflamatórios por estimulação da vacina contra HPV em células T CD8+.*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.

(0.29MB).

Para analisar melhor o efeito da vacina contra o HPV no CECC em modelo animal, foi levantada a hipótese de que a adição da vacina contra o HPV aumentaria a imunogenicidade e os efeitos antitumorais do tratamento com PD‐1 em camundongos. Para testar essa hipótese, dez camundongos com CECC foram divididos em dois grupos de cinco camundongos cada e foi injetado PD‐1 Abs (10377‐M94, SinoBiological) ou PD‐1Abs + vacina contra o HPV. Não foi criado um grupo sem tratamento que refletisse o efeito terapêutico do PD‐1 no CECC, porque em outros estudos concluiu‐se que o anticorpo monoclonal PD‐1 tem efeito inibitório significante no CECC.22‐25 Para monitorar a resposta antitumoral, o volume do tumor foi medido a cada cinco dias e os camundongos foram submetidos a eutanásia no 30° dia; o tecido tumoral foi então isolado e pesado (fig. 3A). Em comparação com o grupo PD‐1Abs, os tumores no grupo PD‐1Abs+vacina HPV diminuíram de peso (fig. 3B) e volume (fig. 3C) no 30° dia, o que demonstrou que regressão estável foi observada nos tumores em todos os grupos. A análise dos tecidos tumorais de camundongos com imunofluorescência mostrou aumento significante na infiltração intratumoral de CD8, CD4, NK, DC e macrófagos em camundongos que receberam anticorpo monoclonal PD‐1 combinado com vacina contra o HPV (fig. 4).

Figura 3.

Impacto da vacina contra HPV combinada com anticorpo monoclonal PD‐1 para CECC. (A) Imagem tumoral. (B) Alteração de volume. (C) Alteração de peso. ***p<0.001.

(0.26MB).

Figura 4.

Efeito da vacina contra HPV combinada com anticorpo monoclonal PD‐1 na imunofluorescência em camundongos. (A) Observação por imunofluorescência de diferenças no microambiente imunológico (CD8, CD4, NK, DC, macrófago). (B) Análise estatística utilizando o software Image J da porcentagem de células imunológicas positivas. ***p<0,001.

(1.23MB).

A fim de observar o efeito da vacina contra HPV em m6A em tecidos tumorais, foi analisado o conteúdo de m6A em tecidos tumorais de camundongos usando método colorimétrico e Dot blot, e observou‐se que o conteúdo de m6A no grupo de PD‐1Abs+vacina contra o HPV foi significantemente menor do que no grupo PD‐1Abs (fig. 5). Avaliou‐se também a expressão de m6A metil‐esterase e desmetilase por qPCR, e os resultados foram mostrados em 3H. METTL3 foi regulado negativamente de maneira significante na presença da vacina contra o HPV, enquanto as diferenças de METTL14, RBM15, WTAP, VIRMA, FTO e ALKBH5 não foram estatisticamente significantes (fig. 6A). A regulação negativa da expressão de METTL3 ao nível de proteína no grupo PD‐1Abs+vacina contra o HPV foi também verificada por Western blot (fig. 6B).

Figura 5.

Expressão de mRNA e proteína m6A em tecidos tumorais. (A) Análise colorimétrica do conteúdo de m6A em tumores. (B) Dot blot para verificar o conteúdo de m6A em tecido tumoral.***p<0,001.

(0.09MB).

Figura 6.

Seleção de alvos com expressão aberrante de m6A. (A) PCR em tempo real para rastrear a expressão de metilesterase e desmetilase relacionadas a m6A em tecidos tumorais; (B) Western blot para verificar a diferença da expressão de METTL3. ***p<0,001.

(0.27MB).

Para estudos adicionais sobre o efeito da vacina contra HPV na expressão de METTL3 no CECC, foi realizada a superexpressão de METTL3, e qPCR e Western blot foram realizados para detectar a eficiência de superexpressão nos níveis de mRNA e proteína (fig. 7). O ensaio CCK‐8 revelou que não houve diferença significante na atividade celular entre os seis grupos após 24 horas de incubação. Após 96 horas de cultura, a atividade celular foi significantemente reduzida quando cocultivada com células T CD8+ e células A431 em comparação com o grupo controle, com maior redução na atividade das células A431 após a adição da vacina contra HPV, com diferenças estatísticas em todos os grupos. Após a superexpressão de METTL3, demonstrou‐se o efeito inibitório das células T CD8+ e da vacina contra o HPV na atividade das células A431, e a atividade das células A431 foi significantemente maior no grupo de células T CD8++vacina contra HPV‐OE‐METTL3 do que no grupo células T CD8++vacina contra o HPV‐OE‐NC (fig. 8A). Além disso, m6A foi avaliado em cada grupo e observou‐se que a vacina contra o HPV reduziu significantemente o conteúdo total de m6A no sistema de cocultura, enquanto a superexpressão de METTL3 aboliu significantemente esse efeito. Curiosamente, o conteúdo de m6A no grupo de células T CD8++vacina contra HPV‐OE‐NC não foi estatisticamente diferente de modo significante do grupo Controle‐OE‐NC, enquanto o conteúdo de m6A no grupo de células T CD8+‐OE‐NC foi elevado em comparação com o grupo Controle‐OE‐NC, embora sem diferença estatística (fig. 8B).

Figura 7.

Identificação de superexpressão de METTL3. PCR em tempo real e Western blot verificaram a eficiência da superexpressão de METTL3. ***p<0,001.

(0.17MB).

Figura 8.

Mecanismos da suscetibilidade aumentada do CECC à imunoterapia, induzida pela vacina contra HPV. (A) Ensaio CCK8 revelou que a vacina contra o HPV promoveu significantemente o efeito supressor das células T CD8+ nas células A431, enquanto a superexpressão de METTL3 atenuou o efeito supressor do tratamento com a vacina contra o HPV nas células A431 pelas células T CD8+. (B) O ensaio m6A revelou que a vacina contra o HPV reduziu significantemente o conteúdo total de m6A no sistema de cocultura de células T CD8++células A431, enquanto o knockdown de METTL3 aboliu significantemente este efeito. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.

(0.35MB).

Para avaliação adicional do efeito de METTL3 na vacina contra o HPV no CECC, foram realizadas experiências de xenoenxerto de tumor. Os modelos de camundongos com CECC foram divididos em quatro grupos de cinco camundongos cada e foi administrado tratamento com PD‐1Abs+OE‐NC, PD‐1Abs+vacina contra o HPV+OE‐NC, PD‐1Abs+OE‐METTL3 e PD‐1Abs+vacina contra o HPV+OE‐METTL3, respectivamente. Na combinação do anticorpo anti‐PD‐1 com a vacina contra o HPV, o volume e o peso do tumor foram significantemente reduzidos, e o cotratamento com a vacina contra o HPV e o anticorpo anti‐PD‐1 de camundongo resultou na inibição completa do crescimento do tumor, enquanto o efeito inibitório do anticorpo anti‐PD‐1 no volume e peso do tumor foi atenuado após superexpressão de METTL3 (fig. 9). Histologicamente, verificou‐se que o grupo PD‐1Abs+vacina contra HPV+OE‐NC apresentou infiltrados intratumorais significantemente maiores de CD8, CD4, NK, DC e macrófagos do que os outros grupos (fig. 10).

Figura 9.

Validação em modelo animal da superexpressão de METTL3 abolindo a vacina contra o HPV para aumentar a sensibilidade de camundongos com CECC tratados com anticorpo monoclonal PD‐1. (A) Imagem tumoral. (B) Alteração de volume. (C) Alteração de peso. ***p<0,001.

(0.4MB).

Figura 10.

Efeito da superexpressão de METTL3 na terapia combinada avaliado na imunofluorescência. (A) Observação por imunofluorescência de diferenças no microambiente imunológico (CD8, CD4, NK, DC, macrófago). (B) Análise estatística com o software Image J da proporção de células imunes positivas.***p<0,001.

(0.89MB).