Neste estudo, o dispositivo Signstek Portable High Frequency Machine (Signstek, Full Rise LLC, Wilmington, DE/EUA) com marcação CE (aprovada para uso em seres humanos na Europa) foi utilizado. Consiste em dispositivo portátil com um regulador de intensidade na parte inferior e uma saída para conectar diferentes tubos de vidro preenchidos com hélio abaixo da pressão atmosférica. São fornecidos quatro tubos de vidro diferentes: um tubo em formato de pente para tratar o couro cabeludo, um tubo em formato de língua para áreas sensíveis (como olheiras, nariz ou lábios), outro em formato de cogumelo para grandes áreas (regiões frontal e dorsal) e um tubo curvo com ponta esférica para áreas regulares como a região bucinadora (fig. 1a).

Figura 1.

Fonte de plasma e efeitos do mecanismo. (A) O dispositivo de plasma é composto por um dispositivo portátil com ajuste de intensidade e diferentes tubos de vidro para conectar. Há formação de plasma de cor laranja quando ligado. (B) Fotos tiradas com câmera termográfica após 0, 1, 2 e 4 minutos sem nenhum sinal de desenvolvimento de calor. (C) Formação de ozônio durante o tempo medido por um detector de O3 demonstrando aumento da concentração de O3 já depois de 10 minutos. A linha tracejada indica a concentração limite de odor para ozônio (20‐40μg/m3; 0,01‐0,02ppm).

(0.47MB).

Em todos os experimentos relatados aqui, o tubo curvo foi utilizado a uma frequência de trabalho de 50Hz A intensidade foi regulada em 50%.

A intensidade da corrente foi medida para três condições (potência baixa, média e máxima) utilizando amperímetro padrão (Multimeter ABB Metrawatt 2012). A tensão aplicada correspondia à da tomada elétrica (na Alemanha: 230V).

Para investigações adicionais sobre o mecanismo preciso de ação da fonte de plasma, uma câmera de imagem térmica (FLIR MS Technology C3, FLIR® Systems, Inc., Wilsonville, Oregon, EUA) foi utilizada para detectar o potencial desenvolvimento de calor. As fotos foram tiradas após 1, 2 e 4 minutos de tratamento de uma placa de ágar com AF para se assemelhar a um experimento com bactérias.

A concentração de ozônio (O3) foi medida utilizando um detector de O3 (Leory PM 2.5 O3 Ozondetektor TVOC, Thingnovation, Shenzhen, China). A fonte de plasma foi ligada a 100% em uma sala com janelas e portas trancadas, de aproximadamente 10,5 m3. Os tempos de medida foram aos 10, 20, 30, 40 e 50 minutos.

A flora da pele de três diferentes áreas do corpo foi isolada em placas de ágar sangue e incubada por 24 horas a 37°C antes do tratamento com AF.

Propionibacterium acnes, como bactéria anaeróbica, foi cultivada em um frasco anaeróbio (BD BACTEC™ Lytic/10 Anaerobic/F Culture Vial) até atingir densidade celular aproximada de 3,0×108 UFC/mL referente ao padrão McFarland n° 1, e em seguida tratada com AF em uma placa de ágar sangue. Após o tratamento, as placas foram incubadas por sete dias a 37°C em condições anaeróbicas usando BD GasPakTM. Espécies fúngicas foram cultivadas em BD Dermatophyte Agar por sete dias a 37°C antes do tratamento.

Após a incubação, cada colônia investigada foi ressuspensa em aproximadamente 0,5mL de solução salina 0,9% estéril. Para a flora da pele, foram escolhidas cinco colônias de aparência morfologicamente diferente para avaliação posterior. Em seguida, 1μL da solução microbiana foi aplicado centralmente nas placas de ágar apropriadas em pares. Em seguida, o dispositivo de AF com o tubo curvo anexado e desinfetado com lenço umedecido foi fixado em um suporte a uma distância de 5mm acima da placa. De cada par, uma placa foi tratada por 1 minuto, enquanto a outra serviu como controle para determinar a diferença relativa. No caso de P. acnes, os períodos de tratamento variaram entre 1 e 8 minutos (1, 2, 4 e 8 minutos de tratamento de AF). Subsequentemente, a solução microbiana de placas tratadas e não tratadas foi espalhada utilizando esferas de vidro esterilizadas, seguido por um período de incubação a 37°C por um dia para a flora da pele e sete dias para P. acnes e fungos. Após a incubação, em placas com aproximadamente mais de 1.000 colônias, três áreas de 1cm2 foram contadas em cada placa de ágar, e os valores médios foram multiplicados pelo tamanho da placa de ágar (57cm2) para obter o número absoluto de colônias por placa. Placas com 100 a 1.000 colônias foram divididas em quartos, e um quarto contado foi multiplicado por quatro, enquanto placas com menos de 100 colônias foram contadas de maneira completa.

As colônias bacterianas de cada par de placas foram ainda caracterizadas por meio de PCR (Kit HotStarTaq Master Mix, Qiagen), como descrito anteriormente.9

Os primers 27f (5’‐AGA GTT TGA TCA TGG CTC A‐3’) e 1492r (5’‐TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T‐3’) amplificaram parcialmente o rRNA do gene 16S usando um termociclador (Biometra Professional Basic, Analytik Jena GmbH, Jena, Alemanha).

Os produtos de DNA foram detectados por eletroforese em gel de agarose a 1,0% para confirmar uma amplificação bem sucedida. O sequenciamento de Sanger foi realizado pela Eurofins Genomics (Ebersberg, Alemanha) utilizando o primer 27f. As sequências obtidas foram alinhadas usando a ferramenta online BLASTn para identificar as espécies (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi; NCBI).10

Para observação e análises estatísticas (teste t de Student não pareado para amostras armazenadas em linha) foi utilizado o GraphPad Prism (versão 9.0.0, GraphPad Software Inc, San Diego, CA/USA) e os dados foram dispostos em gráficos em escala logarítmica. Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Os valores a seguir são apresentados como média±desvio padrão. O nível de significância foi estabelecido em p <0,05 (*), p <0,01 (**) e p <0,001 foram considerados altamente significativos (***).

Para avaliar a intensidade da corrente elétrica durante o tratamento, foi utilizado um multímetro mostrando corrente variando de 0,28 (potência total) a 0,32 ampère (potência baixa) na tensão de 230V.

O desenvolvimento de calor após 1, 2 e 4 minutos de tratamento com AF não foi observado. As fotos tiradas com câmera termográfica não mostraram alterações na temperatura durante o período investigado (fig. 1 B).

A formação de ozônio com concentração de 0,015ppm foi observada após 10 minutos do dispositivo totalmente ligado. Após 20 minutos, as concentrações de O3 quase dobraram (c=0,027ppm). Com tempos maiores os níveis de concentração aumentaram (c=0,032 após 30 minutos, c=0,040 após 40 minutos, c=0,090 após 50 minutos; fig. 1C).

Para avaliar a eficácia da terapia de AF contra a flora comum da pele, as placas de ágar sangue com e sem tratamento de AF foram contadas após o período de incubação seguido por PCR para especificar as espécies bacterianas. Em termos gerais, para quase todas as espécies identificadas, observou‐se redução significativa na contagem de colônias. Mais precisamente, na região frontal, detectamos duas vezes Micrococcus yunnanensis, Aerococcus viridans, Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus capitis. Micrococcus yunnanensis foi reduzido em 67,5% (31267,0±81,7 vs. 1016,3±57,1; p <0,001) e na segunda placa em 12,5% (6405,0±18,5 vs. 5605,3±19,4; p <0,001), A. viridans em 26,1% (9339,0±72,1 vs. 6906,3±58,8; p <0,001), S. epidermidis em 83,43% (3785,7±68,7 vs. 627,3±18,2; p <0,001) e S. capitis em 41,9% (1488,0±70,4 vs. 864,3±30,3; p <0,001).

O mesmo foi observado para as bactérias do antebraço: B. cereus foi reduzido em 75,9% (11396,3±757,7 vs. 2750,7±127,9; p <0,001), S. capitis em 63,9% (2700,3±104,0 vs. 973,7±25,1; p <0,001), A. urinaeequi em 95,1% (16201,0±757,9 vs. 800,0±35,0; p <0,001), M. yunnanensis em 99,0% (7209,3±344,8 vs. 75,0±12,8; p <0,001) e M. luteus em 3,1% (6280,0±443,3 vs. 6087,7±119,3; p=0,5).

Em relação às espécies bacterianas na região genital, S. capitis foi reduzido em 81,6% (31699,3±763,7 vs. 5839,7±111,3; p <0,001), S. lugdunensis em 97,6% (15214,3±405,1 vs. 363,3±16,2; p <0,001), M. luteus em 17,9% (957,0±37,6 vs. 785,3±2 2,3; p=0,002), S. haemolyticus em 99,0% (6684,0±273,0 vs. 70,0±7,2; p <0,001), M. yunnanensis em 70,3% (4322,0±252,3 vs. 1284,3±86,4; p <0,001; fig. 2 A).

Figura 2.

Efeitos antimicrobianos da terapia de AF. (A) Tratamento com AF mostra diminuição significativa da contagem de bactérias e (B) fungos in vitro. (C) UFC de P. acnes são significativamente reduzidas após 1 minuto, e a continuação do tratamento leva a redução adicional.

(0.36MB).

O próximo passo do presente estudo foi avaliar adicionalmente os efeitos do tratamento da AF contra uma seleção aleatória de dermatófitos. O número total de colônias de todos os dermatófitos foi significativamente reduzido em 58,0% após o tratamento com AF (55,8±33,6 vs. 18,2±6,5; p=0,040). Mais precisamente, as colônias de T. mentagrophytes foram reduzidas em 61,5% (69,3±4,0 vs. 26,7±3,1; p <0,001), de T. violaceum em 78,6% (103,0±6,6 vs. 22,0±3,0; p <0,001), de T. benhamiae em 45,2% (17,7±1,5 vs. 9,7±1,5; p=0,003), de M. canis em 69,1% (65,7±2,1 vs. 20,3±1,5; p <0,001) e de T. rubrum em 61,6% (31,3±1,5 vs. 12,0±2,0; p <0,001; fig. 2 B).

Uma abordagem adicional para verificar se o tratamento de AF é benéfico contra P. acnes, este foi tratado por AF ao longo do tempo (fig. 2C). As UFC em diferentes placas de ágar sangue foram contadas antes e após 1, 2, 4 e 8 minutos de tratamento com AF. Resultados significativos foram alcançados após 1 minuto de tratamento (7288,0±145,9 vs. 30,0±3,6; p <0,001). A continuação do tratamento por 2, 4 e 8 minutos levou a diminuição ainda maior da quantidade de UFC. Ao comparar os valores após 2 e 4 minutos de tratamento, observou‐se redução ainda mais significativa do número de UFC de P. acnes (4,7±0,6 vs. 1,3±1,5; p=0,020). O tratamento prolongado por mais de 8 minutos pareceu não ter benefícios adicionais (1,3±1,5 vs. 1±0; p=0,700; fig. 2C).