O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (projeto 31608) e pela Plataforma Brasil (CAAE 2.481.885).

O painel de genes de NGS foi desenhado com a finalidade de ser específico para EB, resolver a extensa maioria dos casos da doença e apresentar um preço viável para a realidade brasileira. Assim, os 11 principais genes associados aos quatro tipos de EB foram incluídos no painel (KRT5, KRT14, PLEC, TGM5, LAMA3, LAMB3, LAMC2, COL17A1, ITGB4, COL7A1 e FERMT1). O painel de 62,72kb e 574 amplicons foi desenhado a partir da ferramenta AmpliSeq Designer (Thermo Fisher Scientific, EUA). A tecnologia ion torrent (Thermo Fisher Scientific, EUA) foi empregada para o sequenciamento. Informações sobre os parâmetros das corridas, análise de dados, investigação, classificação e detalhamento das variantes identificadas foram descritas em estudo prévio.13

A fim de se obter uma estimativa do valor a ser investido para a execução das técnicas de MIF, MET e sequenciamento por painel de genes, foi realizado levantamento de preços em hospitais/laboratórios brasileiros que executam cada um desses métodos. Para a técnica de MET foi realizado levantamento em laboratórios dos EUA, uma vez que o Brasil não tem laboratórios que realizem o método para diagnóstico de EB. Como o custo do sequenciamento pelo painel de genes depende do número de amostras a serem analisadas, para fins de cálculo, a estimativa de preço levou em consideração um número de 20 amostras. As características de cada método, bem como suas vantagens e desvantagens inerentes, foram revisadas em literatura especializada.

As técnicas de MIF e MET são, historicamente, as mais empregadas para o diagnóstico da EB e possibilitam a determinação do nível de clivagem na pele e a consequente indicação do tipo de EB associada.5 Ainda que apresentem precisão diagnóstica para o tipo principal de EB, esses métodos não indicam o modo de herança genética e dependem de experiência para análise, estando sujeitos a frequentes resultados imprecisos ou inconclusivos (tabela 1).3,14 A MET, em especial, é uma técnica bastante laboriosa e que necessita de notável conhecimento técnico – é, por isso, muito pouco empregada em todo o mundo. A identificação da variante patogênica associada é o critério mais definitivo e preciso para o diagnóstico de EB. O sequenciamento dos genes candidatos pelo método de Sanger é, portanto, realizado em centros especializados, posteriormente ao MIF e/ou à MET.5,14 Ainda que informativa na maioria das vezes, a combinação dos métodos de MIF, MET e sequenciamento de Sanger falha em aproximadamente 15% dos casos, seja por incerteza no exame clínico ou por limitações intrínsecas das técnicas.8 Ademais, essa abordagem combinada pode apresentar alto custo e exigir grande demanda de trabalho, visto que diversos dos genes associados à EB contêm múltiplos éxons, como o COL7A1 (118 éxons) e o COL17A1 (56 éxons).8

Diferentemente do sequenciamento de Sanger, o painel de genes por NGS torna possível o sequenciamento simultâneo de um grande número de genes com conhecida associação à doença,1 dispensando a determinação prévia de genes candidatos. A análise genética pelo painel de genes é rápida, de alta precisão e conclusiva para o diagnóstico da EB, sem demandar a realização de exames prévios como MIF e MET (tabela 1).

Os métodos de MIF e MET requerem biópsia de pele, geralmente realizada a partir de bolha íntegra recente. Esse exame por si só já é altamente invasivo, mas em pacientes com EB, que apresentam uma pele tão frágil, torna‐se ainda mais agressivo. Ainda, não é incomum a necessidade de repetição de biópsia em alguns pacientes, em decorrência de resultados inconclusivos. Uma vez que as análises por NGS dispensam a necessidade de biópsia, podem ser realizadas com amostra de saliva e fornecem diagnóstico com rapidez e alta precisão, autores têm defendido que os métodos atuais para avaliação dos pacientes com EB devem ser repensados.15 A identificação das variantes causais associadas à EB possibilita a indicação do prognóstico da doença, o diagnóstico genético pré‐natal e pré‐implantacional e o aconselhamento genético preciso.3

Embora o sequenciamento por NGS seja uma ferramenta poderosa para o diagnóstico genético, algumas limitações devem ser consideradas. O principal desafio se refere às análises de bioinformática, essenciais para a identificação das variantes genéticas e, ainda mais importante, para indicar sua causalidade.8 Nesse sentido, a interpretação de variantes de significado incerto pode ser bastante difícil, causando dilemas para os clínicos e incertezas de como informar os pacientes e fornecer o aconselhamento genético apropriado. Além disso, grandes rearranjos e sequências repetitivas são complexos de se analisar por NGS e, por isso, frequentemente não são detectados de maneira correta. Portanto, é importante notar que, embora altamente efetiva, a tecnologia de NGS não é capaz de solucionar todos os casos de doenças genéticas.

O painel de genes desenvolvido por nosso grupo apresentou alta eficiência (94,3%) na amostra estudada, equiparada aos resultados obtidos por outros pesquisadores que utilizaram painéis com um número maior de genes.10–12 A escolha pelos 11 principais genes associados à EB se deu a fim de se estabelecer uma metodologia economicamente viável, ainda que conhecidamente existam outros genes também reportados na literatura.2,3 Embora o painel desenvolvido falhe em diagnosticar raros casos associados a outros genes (como DST, EXPH5, KLHL24, CD151, ITGA3 e ITGA6), a eficiência aqui obtida demonstra que mesmo um painel de genes menor pode ser de notável relevância para o diagnóstico da EB. Cabe destacar que a metodologia de NGS não torna possível a identificação adequada de grandes rearranjos genéticos, o que pressupõe que mesmo um painel incluindo todos os genes já associados à EB não garante 100% de eficiência.

Afora os benefícios imediatos, a análise genética pode ser uma ferramenta essencial para o desenvolvimento e a aplicação de terapias para EB. Embora atualmente não exista tratamento, recentes estudos pré‐clínicos têm sugerido potenciais terapias para EB, muitas delas dependentes da variante patogênica associada.16–20 O avanço no diagnóstico genético por meio da tecnologia de NGS, caminhando junto com o desenvolvimento de novas terapias moleculares, promete trazer benefícios significativos a esse grupo de pacientes.21 Ainda que não seja uma realidade atual, é possível que, em um futuro não muito distante, pacientes com variantes patogênicas específicas tenham possibilidade de tratamento.

Embora o custo estimado por amostra para o painel de genes (R$ 800,00) seja maior comparado ao do MIF (R$ 500,00), ele é consideravelmente menor em relação à MET (US$ 980,00; R$ 3.920,00). É importante notar, entretanto, que o custo da MET foi baseado nos preços praticados em laboratórios dos EUA, visto que, ao que sabemos, o método não é oferecido comercialmente no Brasil. Ainda que algumas universidades brasileiras disponham de um microscópio eletrônico, a realização do método para diagnóstico da doença se dá apenas em contexto acadêmico para casos de específico interesse científico. O sequenciamento de Sanger apresenta um preço médio de R$ 35,00 por fragmento gênico analisado (geralmente um éxon), por amostra. Assim, o valor final dessa metodologia depende do número de éxons dos genes analisados. Hipoteticamente, se um indivíduo com EB distrófica (associada ao gene COL7A1) fosse analisado por sequenciamento de Sanger, seria investido um valor de aproximadamente R$ 2.520,00 apenas com essa metodologia (levando‐se em consideração um número de 72 pares de primers que englobam os 118 éxons do gene, como descrito por Christiano et al.22).

Desse modo, ainda que o painel de genes não seja um método de baixo custo, o resultado obtido a partir dele é mais informativo e conclusivo do que o obtido por MIF e MET. Em comparação ao sequenciamento de Sanger, o valor a ser investido é menor, assim como o tempo de processamento, evidenciando o custo‐efetividade do painel de genes para o diagnóstico de EB. Além disso, o preço dessa metodologia vem diminuindo ao longo do tempo, o que deve tornar o método mais acessível nos próximos anos.10

Cabe ressaltar, porém, que o custo estimado nesse estudo para o diagnóstico por meio do painel de genes não incluiu o preço da compra do painel (aproximadamente R$ 20.000,00) e o investimento para validá‐lo. Nossa proposta aqui é o diagnóstico genético no contexto de saúde pública, visando, em longo prazo, incluir o maior número de pacientes com EB do Brasil. Assim, à medida que mais pacientes são analisados, o custo investido no painel, por paciente, vai diminuindo, até o momento que se torna irrisório. Além disso, não foi adicionado ao cálculo o custo a ser investido em um analista com expertise para análise dos resultados. Em nossa experiência, realizada em contexto acadêmico, essa questão não se aplicou; entretanto, deve‐se levá‐la em consideração antes de estabelecer o método no âmbito de assistência pública.

O diagnóstico da EB no Brasil é feito, na maioria dos casos, por avaliação dos sinais clínicos apresentados. São poucos os centros especializados que disponibilizam os métodos de diagnóstico de EB, o que resulta em dificuldade para diagnosticar e subclassificar os pacientes e, consequentemente, fornecer correto acompanhamento e aconselhamento genético.

Mesmo quando disponível, o MIF frequentemente proporciona resultados inconclusivos, em razão da falta de analistas experientes, especialmente em regiões brasileiras mais pobres e de difícil acesso. Levando‐se em consideração o dano causado pelas biópsias de pele e que a maior parte dos pacientes não tem as condições apropriadas (incluindo os curativos e os cuidados de saúde adequados), alguns médicos têm optado por não indicar MIF para subclassificar EB. Consequentemente, o diagnóstico preciso e a definição do tipo de EB dependem de um exame clínico completo. Entretanto, mesmo se realizado por dermatologista especialista em EB, o exame clínico não é suficiente para resolver todos os casos, tendo em vista a extrema variabilidade fenotípica observada. A tabela 2 apresenta um exemplo de caso clínico cujo resultado genético não coincidiu com a hipótese clínica prévia, surpreendendo os dermatologistas. Casos similares foram descritos em estudos anteriores e indicaram que o efeito das variantes genéticas pode resultar em fenótipos clínicos atípicos.23,24

Em nossa experiência brasileira, constatamos que, para a maior parte dos casos, o preciso diagnóstico acerca do tipo de EB associado só foi possível após o resultado genético, que por sua vez tornou possível o correto aconselhamento genético. Além disso, algumas peculiaridades do país também são importantes. As taxas de endogamia e consanguinidade são maiores em algumas populações brasileiras, especialmente na região Nordeste, o que sugere uma alta prevalência de herança genética recessiva.25,26 De fato, em estudo anterior encontramos que 82,7% dos pacientes brasileiros com subtipos de EBD apresentavam herança recessiva.13 A determinação do padrão de herança é especialmente importante para o diagnóstico dos subtipos localizados de EBD, uma vez que as formas dominante e recessiva são clinicamente indistinguíveis, o que prejudica o correto aconselhamento na ausência de teste genético.

Considerando a dificuldade de se realizar um diagnóstico clínico preciso e, particularmente, a complexidade de classificar a EB, o resultado genético tem provado ser essencial para a correta determinação do tipo de EB associado.

O levantamento realizado neste estudo demonstrou que o painel de genes é uma ferramenta efetiva para o diagnóstico conclusivo da EB, com alta eficiência, precisão diagnóstica e reduzido tempo de análise (cerca de 10 dias), economicamente viável e que dispensa a necessidade de exames invasivos (fig. 1). Alguns fatores, entretanto, são essenciais para a efetividade do método. O processamento dos resultados do painel de genes requer suporte de bioinformatas e o tempo de análise das variantes depende da experiência do investigador. Entretanto, em comparação com os métodos de MIF e MET, a interpretação dos resultados do painel de genes é mais simples, e não requer uma equipe com profunda expertise.3

Tendo em vista a maior eficiência diagnóstica, a robustez do resultado obtido, o preço comparável às técnicas hoje já realizadas e a possibilidade de aconselhamento genético, de prognóstico e de diagnóstico pré‐natal, o presente estudo apoia a utilização do painel de genes como primeira escolha para o diagnóstico da EB no Brasil. Levando‐se em consideração as dimensões continentais do território brasileiro e a dificuldade de se introduzir uma técnica minuciosa como o painel de genes, o estabelecimento de um centro de referência para o diagnóstico da EB no país traria muitos benefícios. A centralização das análises em um único lugar dispensa a necessidade de criação de múltiplas equipes especializadas e reduz o custo de processamento por amostra.

A dificuldade de diagnóstico dos pacientes com EB no Brasil pode ser atenuada com a abordagem metodológica aqui proposta. Para a efetivação da ideia, são necessários recursos financeiros e apoio governamental. É essencial que as autoridades atentem para esse grupo de pacientes que apresenta uma doença genética grave e que, ainda que rara, representa um conjunto de mais de 900 brasileiros.