Este relato está em conformidade com as diretrizes do programa STROBE‐ME (Strengthening the Reporting of Observational studies in Epidemiology – Molecular Epidemiology).14 O estudo foi conduzido em um centro terciário de tratamento de pacientes com psoríase no Hospital Universitário de Brasília, localizado em Brasília, Brasil. Esse centro atende uma população de mais de um milhão de pessoas, e os pacientes são encaminhados de instituições secundárias.

De 1° de novembro de 2022 a 1° de dezembro de 2023, foram incluídos pacientes consecutivos atendidos no Ambulatório de Psoríase. Para formar o grupo principal de análise, foram incluídos pacientes acompanhados regularmente no Hospital Universitário de Brasília e que tinham história confirmada de psoríase vulgar grave (Classificação Internacional de Doenças 10ª Revisão [CID10=L40.0], Psoriasis Area and Severity Index [PASI> 10] ou Dermatology Life Quality Index [DLQI> 10]) e que posteriormente alcançaram remissão da doença (PASI ou DLQI <5) por pelo menos um ano após o uso de metotrexato ou biológicos. Pacientes consecutivos com psoríase que foram encaminhados a esse centro dermatológico especializado durante o mesmo período e que não estavam recebendo tratamento sistêmico também foram incluídos para formar um grupo de comparação. Vinte controles saudáveis pareados por sexo e idade aos pacientes com psoríase também foram incluídos (amostragem de conveniência) para comparação. Foram excluídos pacientes com quaisquer outras condições autoimunes (exceto artrite psoriásica), gestantes ou indivíduos de etnia indígena. Todos os testes de mutação e expressão gênica foram realizados em todos os pacientes.

Após assinarem o termo de consentimento livre e esclarecido, todos os pacientes preencheram questionário abrangente com o objetivo de coletar informações clínicas detalhadas. As informações solicitadas incluíam idade, sexo, tempo de diagnóstico de psoríase e medicamentos utilizados anteriormente para o tratamento da doença. Todos os pacientes também foram examinados por dois dermatologistas certificados, que coletaram dados relacionados ao tipo e à gravidade da psoríase (escores PASI e DLQI).

No grupo de análise principal, todos os pacientes com psoríase foram acompanhados regularmente por mais de um ano e já haviam alcançado resposta clínica satisfatória ao tratamento sistêmico. Após a inclusão no estudo, os pacientes foram divididos em dois grupos principais: 1) aqueles que desenvolveram perda de resposta ao tratamento sistêmico (definida como a recorrência de um ou ambos os seguintes escores – PASI> 10 ou DLQI> 10 – após tratamento previamente eficaz); e 2) aqueles que continuaram a apresentar resposta eficaz e sustentada ao tratamento sistêmico. Embora o grupo de pacientes que não recebeu nenhum tratamento sistêmico também tenha sido dividido em pacientes com PASI ou DLQI> 10 ou não, o termo “perda de resposta ao tratamento sistêmico” não foi utilizado para esse grupo.

Foram coletados 20mL de sangue total dos participantes do estudo em dois tubos de heparina. Imediatamente após a coleta, as CMSP foram isoladas usando um gradiente Ficoll Paque Plus (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha). As amostras foram armazenadas em RNA Later (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA) a −80°C até a extração do RNA, que foi realizada até um mês após a coleta da amostra. Sangue total e plasma também foram armazenados a −80°C.

O RNA total das CMSP foi extraído usando o kit mirVana™ PARIS™ RNA and Native Protein Purification (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA). O RNA purificado foi quantificado com um espectrofotômetro UV‐Vis NanoDrop One/OneC (Thermo Fisher Scientific). As amostras foram tratadas com DNase I livre de RNase (1 U/μL; Thermo Fisher Scientific). O DNA complementar (cDNA) foi gerado utilizando kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade (Thermo Fisher Scientific) em termociclador T100 (Bio‐Rad, Hercules, EUA), de acordo com as instruções do fabricante.

A análise da expressão do RNA mensageiro (mRNA) foi realizada utilizando sondas fabricadas com TaqMan (Thermo Fisher Scientific) marcadas com sondas 5’fluoresceína amidita (FAM) e 3’minor groove binder (MGB). A expressão dos genes TYK2, IL‐12A, IL‐12B, IL‐23A, receptor de IL‐23, IL‐6, IL‐6R, IL‐17A e fator de necrose tumoral (TNF) foi medida usando sondas que abrangem junções de éxon. Apesar de o objetivo principal deste estudo ser a avaliação de citocinas no eixo IL‐23 e outros ativadores dos receptores TYK2, citocinas efetoras como TNF e IL‐17A foram adicionalmente medidas para avaliar e comparar a ativação de toda a via de estimulação Th1 e Th17. Três candidatos a alvo, a saber, gliceraldeído‐3‐fosfato desidrogenase (GAPDH), rRNA 18S eucariótico e beta‐actina, foram rastreados para uso como controles endógenos, e GAPDH foi selecionado. Para cada ensaio, os genes analisados são detalhados na tabela suplementar 1.

As reações foram realizadas em um termociclador QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific). A reação foi iniciada a 50°C por dois minutos, seguida por 95°C por dez minutos (ativação da polimerase) e 40 ciclos de PCR de 95°C por 15 segundos e 60°C por 60 segundos. As reações foram realizadas em volume final de 15μL contendo 1× TaqMan™ Gene Expression Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA), 1× sondas baseadas em TaqMan, 2μL de amostra de cDNA de cada paciente e água ultrapura. Todas as amostras foram testadas em triplicata. Para normalização, foi utilizada amostra de referência (calibrador) formada a partir de um pool de RNA total extraído das CMSP dos 20 controles saudáveis incluídos. Controles sem modelo também foram utilizados para comparação.

O método Ct comparativo (ΔΔCt) foi utilizado para análise dos dados. Os resultados individuais são relatados como quantificação relativa (QR) da expressão gênica (variação de dobra). Os cálculos foram realizados com o software de Análise Applied Biosystems™ (Thermo Fisher Scientific). Os valores de cada expressão considerados imprecisos são suprimidos pelo software de análise.

Um ensaio robusto fabricado que detecta com precisão o SNP protetor relacionado à psoríase rs12720356.19 foi escolhido. Esse SNP foi o único SNP no gene TYK2 que se mostrou relacionado à psoríase e que foi reproduzido em mais de um artigo científico, de acordo com revisão sistemática anterior da literatura e metanálise.19 O kit utiliza qPCR multiplex com sondas [VIC/FAM] para detectar a seguinte mutação no gene TYK2: GTGCTCCACGTACTCTGTCACCATG[A/C]TATCTGTAAAGACACAGCTGCTCTG, localizada no cromossomo 19:10359299 na construção GRCh38. Os transcritos dessa região são semelhantes aos do alvo testado para a expressão do gene TYK2.

O DNA genômico do sangue total foi extraído utilizando o PureLink™ Genomic DNA Mini Kit (Thermo Fisher Scientific). A mistura para genotipagem incluiu 1× TaqPath™ ProAmp™ Master Mix (Thermo Fisher Scientific), 1× TaqManTM SNP Genotyping (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA; CN: C_34042925_10, 4351379), 20 ng de DNA genômico e água ultrapura em volume final de 25μL. As reações foram realizadas em termociclador QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific). As condições de ciclagem compreenderam etapa de pré‐leitura de 30 s a 60°C, seguida por etapa inicial de desnaturação/ativação enzimática de cinco minutos a 95°C; 40 ciclos de desnaturação (15 s a 95°C) e anelamento/extensão (60 s a 60°C); e uma etapa de pós‐leitura de 30 s a 60°C.

Os níveis plasmáticos de TNF‐α, IL‐10, IL‐1β, IL‐8, IL‐6 e IL‐12p70 nos primeiros 80 pacientes incluídos foram medidos utilizando o kit Human Inflammatory Cytokine Cytometric Bead Array (CBA)‐I (RUO; Becton Dickinson, Franklin Lakes, EUA) e um citômetro de fluxo FACSVerse (Becton Dickinson).

Para a análise estatística inicial, o escore PASI foi considerado como o desfecho principal e os pacientes foram divididos em dois grupos: aqueles com PASI> 10 e aqueles com PASI ≤ 10. Outro desfecho importante foi a perda de resposta ao tratamento sistêmico, definida por escore PASI ou DLQI> 10.

Foram exploradas as diferenças nas QRs de expressão gênica e características clínicas. Posteriormente, foram aplicadas técnicas de agrupamento hierárquico e mapas de calor para encontrar grupos de pacientes que pudessem representar um perfil endotípico diferente de indivíduos com perda de resposta ao tratamento sistêmico. Os pressupostos para a análise multivariada não foram atendidos, e essa análise foi considerada não confiável.

A relevância clínica das alterações na expressão gênica foi definida como uma diferença mínima de 2× na expressão gênica (QR) entre os grupos.20,21 Valor de p <0,05 indicou significância estatística. Sempre que a significância estatística foi alcançada para QR, foi aplicado o ajuste da taxa de falsa descoberta (FDR, do inglês false discovery rate) de Benjamini‐Hochberg. A análise estatística foi realizada utilizando o programa R versão 4.1.2 (R Core Team [2021]). R: linguagem e ambiente para computação estatística. R Foundation for Statistical Computing, Viena, Áustria. URL https://www.R‐project.org/).

Todos os pacientes foram incluídos após a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. Este estudo está em conformidade com a Declaração de Helsinque e foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília, Brasil (CAAE: 68068323.3.1001.5558).

Foram recrutados 198 participantes no estudo, incluindo 162 pacientes com psoríase que haviam alcançado remissão da doença previamente com o uso de medicamentos sistêmicos, 16 pacientes com psoríase que não estavam recebendo nenhum tratamento sistêmico e 20 controles saudáveis. Vinte e sete pacientes com psoríase apresentaram escore PASI> 10 (a principal variável dependente), e outros 32 pacientes apresentaram escores DLQI> 10. Os dados da tabela suplementar 2 mostram que sexo, idade e duração da doença não diferiram entre pacientes com escores PASI> 10 e aqueles com escores PASI ≤ 10.

Em relação à medicação utilizada por cada paciente no recrutamento, 21 utilizavam metotrexato, 83 utilizavam agentes biológicos anti‐TNF (cinco etanercepte, sete infliximabe e 71 adalimumabe), 17 utilizavam agentes biológicos anti‐IL‐12/23 (ustequinumabe), sete utilizavam agentes biológicos anti‐IL‐23 (cinco risanquizumabe e dois guselcumabe), 34 utilizavam agentes biológicos anti‐IL‐17 (secuquinumabe) e 16 não utilizavam nenhum tratamento sistêmico. Não foi detectado PASI> 10 em pacientes tratados com agentes biológicos anti‐IL‐23 (n=7; tabela suplementar 3).

A porcentagem de pacientes que apresentaram perda de resposta ao tratamento sistêmico (escore PASI ou DLQI> 10) não diferiu entre aqueles que receberam diferentes tratamentos sistêmicos (p> 0,05). O número de pacientes com escore PASI ou DLQI> 10 foi maior entre aqueles que não receberam tratamento sistêmico do que entre os pacientes que receberam agentes biológicos anti‐TNF, agentes biológicos anti‐IL‐17, agentes biológicos anti‐IL12/23 ou agentes biológicos anti‐IL‐23 (p <0,05; tabela suplementar 3).

Correlação positiva foi encontrada entre a expressão do gene TYK2 (QR) e a expressão de IL‐12A, IL‐23A ou IL‐23R (p <0,05; figura 1 suplementar). Em comparação com as CMSP de controles saudáveis, a expressão do gene QR da maioria dos mediadores foi semelhante ou reduzida nas CMSP de pacientes com psoríase. Resultados semelhantes foram encontrados por meio da análise de ACB (tabelas suplementares 4, 5, 6, 7 e 8).

Figura 1.

A imagem exibe mapa de calor da expressão gênica de mediadores pertencentes à via de sinalização TYK2. Os dados são derivados de 55 pacientes com psoríase que realizaram todas as medições necessárias em suas células mononucleares periféricas e cujos resultados replicados estavam dentro de dois desvios‐padrão. Este gráfico foi gerado usando o programa R versão 4.1.2 (R Core Team (2021)). R: linguagem e ambiente para computação estatística. R Foundation for Statistical Computing, Viena, Áustria. URL https://www.R‐project.org/). TYK2, tirosina quinase‐2; IL, interleucina; R, receptor.

A expressão do gene TYK2 em CMSP estava aumentada em pacientes com PASI> 10 (tabela 1). A correção por FDR revelou que, isoladamente, a expressão do gene QR de TYK2 não conseguiu diferenciar pacientes com PASI> 10 daqueles com PASI ≤ 10. Esse resultado provavelmente se deve à ampla variação da expressão do gene QR (figura suplementar 2). Além disso, não foi encontrada nenhuma relação entre a expressão do gene TYK2 e outras características demográficas ou clínicas (tabela suplementar 9).

Para a análise de agrupamento hierárquico, foram incluídos apenas pacientes com valores de QR <2 desvios‐padrão para todos os mediadores testados (fig. 1). Foram incluídos 55 pacientes nessa análise (tabelas 2 e 3), e um grupo de 19 pacientes foi identificado com expressão aumentada de mediadores da via de sinalização TYK2. IL‐12A, IL‐12B, IL‐23A, IL‐23R e IL‐6 estavam com expressão positiva nesse grupo (tabela 2). Esse grupo de pacientes também apresentou escores PASI (p=0,021) e DLQI (p=0,034) mais elevados do que aqueles com menor expressão do mediador TYK2 (tabela 3). Pacientes nesse grupo que apresentaram aumento da expressão de mediadores da via de sinalização TYK2 e também perda de resposta ao tratamento sistêmico estavam em uso de metotrexato, agentes anti‐TNF e biológicos anti‐IL‐17, mas não de biológicos anti‐IL‐12/23 ou anti‐IL‐23 (tabela suplementar 10). Os pacientes restantes não apresentaram padrão de expressão gênica em CMSP que os diferenciasse de outros pacientes (n=36; fig. 1).

Três pacientes (1,69%) eram heterozigotos para o SNP rs12720356 identificado no gene TYK2 (fig. suplementar 3). Essa mutação também é conhecida como variante TYK2 I684S.22 Dos três pacientes portadores da variante TYK2 I684S, dois eram mulheres, dois apresentavam psoríase ungueal associada e um apresentava lesões palmoplantares. Todos os três pacientes apresentaram valor de PASI <10. Como a frequência desse SNP foi baixa, não foi possível relacionar esses achados à expressão gênica medida. Nenhuma mutação foi encontrada em controles saudáveis.